局部晚期直肠癌（LARC）患者接受新辅助治疗（TNT）后达到临床完全缓解（cCR）时，在观察等待策略下安全避免根治性手术是可行的，但目前评估治疗反应的临床工具存在局限性。遗憾的是，对仍存在残留肿瘤的患者采用非手术治疗（NOM）会对生存产生不利影响，因此精准筛选适合该方案的患者至关重要。循环肿瘤DNA（ctDNA）检测在微小残留病灶（MRD）检测方面已显示出一定潜力。本研究旨在探讨ctDNA检测MRD的能力，及其作为补充手段评估接受TNT的LARC患者肿瘤反应的价值。本研究为单中心回顾性病例系列研究，纳入2019年至2023年接受TNT治疗的LARC患者，这些患者均接受ctDNA检测，将其作为标准临床反应评估的补充手段。

共有28例患者在TNT治疗后将ctDNA检测纳入治疗反应评估。随访期间，9例患者ctDNA检测呈阳性，19例患者ctDNA检测呈阴性。两组患者的基线特征无差异。本研究中，ctDNA阳性的9例患者中，6例（67%）因存在直肠残留肿瘤需接受手术治疗；而ctDNA阴性的19例患者中，仅4例（21%）需接受手术治疗（p=0.035）。

ctDNA检测在接受TNT治疗的LARC患者中具有检测MRD的潜力。

研究背景

结直肠癌是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。据估计，2025年美国仅直肠癌的新发病例数就将达46,950例。此外，早发性直肠癌的发病率正以惊人的速度上升，预计三分之一的直肠癌新发病例将发生在50岁以下患者中。

放疗联合全身化疗的TNT已成为LARC患者的标准治疗方案。对于达到完全或接近完全临床缓解的患者，可采用NOM，安全避免全直肠系膜切除术（TME）。OPRA试验将TNT与NOM用于完全或接近完全缓解的患者，结果显示50%的LARC患者可安全避免TME。这对患者生活质量具有重大意义，因为TME可能对性功能、泌尿功能和肠道功能造成损害。尽管已有明确的TNT治疗后反应评估方案，但筛选能从NOM中获益的患者仍具挑战性。TNT治疗后的临床反应评估需通过仔细检查完成，包括直肠指检、内镜检查和盆腔MRI。这些检查各有局限性，且检查结果可能存在不一致。约30%接受NOM的患者在随访期间会出现局部肿瘤再生，进而需要挽救性手术。尽管大多数局部再生患者的挽救性手术可成功实施，但与持续完全缓解的患者相比，这些患者的总生存期更短，这可能是由于未被治疗的MRD进展所致。因此，迫切需要寻找其他更精准的MRD检测方法。

目前，研究人员正探索通过ctDNA检测的液体活检技术来检测MRD和转移灶。ctDNA有望在临床或影像学征象出现前检测到复发，且可作为根治性手术后的预后生物标志物。然而，关于ctDNA检测在LARC患者TNT治疗后检测MRD的效用，相关数据仍较为缺乏。研究者推测ctDNA可以检测在观察和等待方案下治疗的LARC患者的MRD，并且它可能被认为是识别可能无法从NOM获益患者的生物标志物。

研究方法

疗效评估采用三级分类体系，即临床完全缓解（cCR）、接近完全缓解（nCR）和不完全缓解（iCR）。局部再生定义为：采用 观察等待策略、且初始评估为 cCR 或 nCR 的患者，在随访期间通过影像学或临床检查再次发现肿瘤。采用 Signatera 检测技术（美国加利福尼亚州圣卡洛斯市 Natera 公司）进行Tumor-informed ctDNA 检测。检测流程如下：从患者血浆中提取循环游离DNA（cfDNA），以检测 ctDNA；同时收集治疗前直肠癌活检组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，以及患者匹配的全血样本（储存于 Streck 管，即循环游离 DNA 专用采血管），将二者送至实验室进行NGS。通过多重聚合酶链式反应（PCR）技术，检测血浆循环游离 DNA 中最多 16 个患者特异性和肿瘤特异性体细胞单核苷酸变异（SNV）。若血浆样本中检测到至少 2 个肿瘤特异性变异，且变异水平超过 Natera 公司检测流程设定的阈值，则定义为 ctDNA 阳性。

研究结果

按ctDNA阳性状态划分的患者组：

共有28例LARC患者在TNT治疗后，将ctDNA检测纳入其疗效评估流程。治疗后随访期间，9例患者ctDNA检测呈阳性，19例患者ctDNA检测呈阴性。两组患者的基线特征详见表1。

表1

ctDNA阳性组与ctDNA阴性组相比，在平均年龄（分别为60岁和66岁，p=0.25）、性别（p>0.9）、肿瘤距肛缘平均距离（分别为5.7 cm和5.9 cm，p=0.84）方面均无差异。两组患者中，临床T3期肿瘤均占多数；且两组中大部分患者存在临床阳性淋巴结转移（阳性组占78%，阴性组占68%，p>0.9）。两组患者的临床T分期与N分期分布无显著差异。绝大多数肿瘤表现为错配修复功能（MMR）正常表达。

TNT治疗完成后的中位随访时间在ctDNA阳性组与阴性组间无显著差异（分别为1.81年和1.47年，p=0.72）。直肠原发肿瘤的确定性手术治疗分为全直肠系膜切除术（TME）或局部切除术（LE），其余患者则采用NOM。在ctDNA阳性组中，6例患者出现局部再生，其中2例接受了LE，4例接受了TME，且这6例ctDNA阳性患者的手术标本中均发现残留肿瘤。在ctDNA阴性组中，4例患者出现局部再生，且4例均接受了TME。本研究中，这4例接受TME的患者中，有1例术后病理提示完全缓解。ctDNA阴性组的NOM率（74%）显著高于ctDNA阳性组（33%），差异具有统计学意义（p=0.035）。ctDNA阳性组中有2例（22%）患者，ctDNA阴性组中有1例（5%）患者出现远处转移。本研究队列中，所有患者术后均未出现局部复发。

为更直观地体现ctDNA检测在TNT治疗后直肠微小残留病灶检测中的效用，研究者按ctDNA阳性状态对患者进行分组，绘制了患者概况图（图1）。

图1

研究者将TNT治疗的最后一天设为时间零点，绘制每位患者随时间变化的ctDNA检测结果。同时，研究者还标注了临床再分期的常规检查结果（包括盆腔MRI、内镜检查/直肠指检），并按“疑似肿瘤”“无肿瘤”或“不确定”进行临床解读。此外，研究者还标注了所有直肠手术干预（LE和TME）事件，以分析ctDNA检测与直肠MRD是否存在相关性。

ctDNA在TNT治疗后采用观察等待策略的患者中，具有检测直肠MRD的潜力：

在ctDNA阳性组中，6例因疑似局部再生需接受手术的患者中，有4例在术前ctDNA检测呈阳性，且无远处转移证据（图1），具体情况如下：

患者LARC20在完成TNT治疗后的初始疗效评估中，MRI和内镜检查提示疑似残留病灶。该患者初始ctDNA检测呈阴性，但后续两次连续检测均转为阳性。同期复查内镜仍提示疑似直肠残留肿瘤。患者接受TME治疗后，病理提示为ypT3N0期直肠癌，术后ctDNA检测转为阴性。

患者LARC27的情况类似，但MRI检查提示无残留肿瘤可能。然而，在系列内镜检查中，患者的肿瘤残留相关特征逐渐加重。术前ctDNA检测呈阳性。患者接受TME治疗后，病理提示为ypT3N0期直肠癌，术后后续ctDNA检测均转为阴性。

患者LARC28采用观察等待策略近1年，期间未发现明显异常。该患者初始ctDNA检测呈阴性，后转为阳性。随访MRI提示腹股沟淋巴结存在可疑特征，但无法确定是否为直肠残留肿瘤。内镜检查未发现病变。患者接受了系列LE和腹股沟淋巴结清扫术，病理提示为ypT2Nx期，且7枚腹股沟淋巴结中有2枚呈阳性。

患者LARC26在局部切除术后（病理提示为绒毛管状腺瘤），继续采用观察等待策略。TNT治疗后1年多，该患者的系列ctDNA检测呈阳性。MRI和内镜检查也提示疑似直肠残留肿瘤。患者随后接受TME治疗，术后病理提示为ypT3N0期直肠癌。

患者LARC4在TME术前未进行ctDNA检测。术后初始ctDNA检测呈阴性，但后续系列检测转为阳性。目前尚未发现明显的局部区域复发或临床转移，其临床意义尚不清楚。

患者LARC10在接受LE手术（病理提示为ypT2Nx期）时，ctDNA检测呈阴性，而术后随访检测转为阳性。目前尚未发现明显的临床转移，该患者仍在密切随访中，以判断此次阳性结果是否为假阳性。

患者LARC2和LARC23在观察等待期间，ctDNA检测也转为阳性，但未发现明确的局部再生或远处转移证据。

在ctDNA阴性组中，4例患者因疑似局部再生需接受手术（图1）：患者LARC14术前ctDNA检测呈阴性，MRI和初始内镜检查结果不确定。复查内镜提示疑似肿瘤，患者接受TME治疗后，病理提示完全缓解。

患者LARC24、LARC11和LARC9术前ctDNA检测均呈阴性，但内镜检查提示疑似肿瘤，因此均接受TME治疗，且手术标本中均发现残留肿瘤。

患者LARC7、LARC3、LARC8、LARC12、LARC19和LARC16初始内镜或影像学检查提示nCR，随时间推移逐渐达到临床完全缓解。患者LARC25、LARC5、LARC6、LARC13、LARC15、LARC17、LARC18、LARC21和LARC1自初始疗效评估以来，一直维持临床完全缓解状态。这些患者在所有随访期间的ctDNA检测均呈阴性。

ctDNA在检测远处转移中的潜在作用：

本研究中有3例患者出现远处转移，其中2例为肺转移，1例为肝转移。研究者绘制了这3例患者的概况图（图2），包含胸/腹/盆腔CT结果和ctDNA检测结果，以分析ctDNA检测能否作为检测转移的有效标志物。

图2

值得注意的是，其中2例患者在CT检测到转移灶前数周，ctDNA检测已转为阳性。患者LARC13在CT确诊转移前，ctDNA检测未呈阳性，但上次ctDNA检测至CT发现转移灶的间隔时间近2年。

讨 论

对TNT治疗完全缓解的患者可能从NOM中获益，但目前评估缓解的临床手段存在局限。遗憾的是，有残留癌的患者选择NOM会对生存产生负面影响，因其更易发生远处转移。因此，采用分子检测（如ctDNA）来检测MRD具有吸引力。在本项包含28例患者的病例系列研究中，研究者展示了ctDNA作为TNT后直肠癌MRD检测生物标志物的潜力。在9例手术标本中发现残留癌的患者里，4例（44%）在术前ctDNA检测为阳性。本研究中，持续的ctDNA阴性与器官保留相关。此外，研究者还证实了ctDNA在随访中作为远处转移检测生物标志物的潜力。

本研究存在若干局限性。这是一项小样本回顾性病例系列，可能存在患者选择偏倚，且ctDNA检测未标准化。28例患者中，1例为错配修复缺陷（MMRd）肿瘤，3例MMR状态未知。由于样本量小，研究者将这些样本合并分析，但需注意TNT疗效会因MMR状态不同而差异，且MMRd肿瘤的DNA释放量更高，会影响ctDNA检测的敏感性。目前，MMRd的局部晚期直肠癌患者采用新辅助PD-1抑制剂多塔利单抗（dostarlimab）治疗，其缓解率达100%。本研究仅分析了有足够肿瘤活检组织以进行 tumor-informed ctDNA检测的患者。尽管超出本研究范围，但对于肿瘤组织不足的患者，也可考虑非肿瘤依赖（仅血浆）的ctDNA检测。此外，虽然研究者制定了标准化的机构临床缓解评估方案，但在研究期间，病历中记录临床缓解的用语并不一致。随访中有4例患者ctDNA转为阳性，但无临床复发迹象。目前尚不清楚这些是假阳性还是真正提示MRD，因为Signatera ctDNA检测在结肠癌复发检测中已显示出8.7个月的提前期。可能需要更长的随访时间才能对这一亚群得出结论。本研究中，研究者并未根据ctDNA结果改变治疗方案，将依赖更大规模的前瞻性试验来阐明对ctDNA阳性进行治疗是否能改善结局。

小规模研究已强调ctDNA与新辅助放化疗临床缓解的关联。在一项纳入44例局部晚期直肠癌患者的研究中，ctDNA检测TNT后残留病灶的敏感性为23%，阴性预测值为47%。尽管本研究未获取患者治疗前的ctDNA，但新辅助治疗后基线ctDNA阳性的清除也与缓解相关。本研究根据ctDNA阳性对患者进行分层，而Signatera还提供每毫升血浆中肿瘤来源突变分子的定量测量及变异等位基因分数，以推断血浆中循环肿瘤DNA的浓度。这两种定量测量彼此相关，且在某些研究中与肿瘤负荷和总生存相关。在近期报告的DYNAMI-III试验中期分析中，每毫升血浆中肿瘤来源突变分子的定量与局部晚期结肠癌切除后复发可能性相关。总体而言，ctDNA检测提供了一种基于分子的生物标志物，有助于未来指导治疗。单独ctDNA检测可能不足以检测MRD，但作为诊断辅助手段，在识别可能无法从NOM中获益的残留癌患者亚群中具有价值。

美国国家癌症研究所结直肠肛门癌工作组最近发布了基于专家共识的建议，以帮助标准化ctDNA采集时间点。工作组建议在新辅助治疗完成后至少4周且在临床重新分期的2周内采集ctDNA。目前多项临床试验正在招募患者，研究ctDNA作为TNT后局部晚期直肠癌缓解评估工具的作用。Janus试验是一项多中心II期试验，研究TNT两组方案（长程放化疗后巩固FOLFOX或FOLFIRINOX化疗）（NCT05610163）。在TNT期间及随访中均采集ctDNA，以与缓解和结局相关联。一项单机构观察性试验在治疗前、TNT期间及随访中采集ctDNA（NCT05081024）。这些试验有望进一步阐明ctDNA在TNT后检测MRD中的作用，并为非手术治疗提供改进方案。

液体活检是一种有前景的辅助手段，可用于识别直肠癌TNT后存在MRD的患者。对于希望保留器官的局部晚期直肠癌患者，应在随访方案或缓解评估中考虑纳入ctDNA检测。

参考文献：

Kim, J.K.; Alden, A.J.; Knaus, S.; Thakkar, R.; Moudgill, L.; Chudzinski, A.; Cavallaro, P.; Martinez, C.; Bennett, R.D.; Marcet, J. Circulating Tumor DNA Detects Minimal Residual Disease in Patients with Locally Advanced Rectal Cancer After Total Neoadjuvant Therapy. Cancers 2025, 17, 2560.