杨渊，桂林医科大学公共卫生学院，桂林 541199

目的 探讨重组人脂联素（adiponectin, APN）对砷诱导肝HepG-2细胞脂质沉积的干预效应及其分子机制。方法 实验分为对照组、亚砷酸钠（SA）染毒组、rAPN干预+SA染毒组、蛋白激酶B（AKT）抑制剂（GSK690693）干预+SA染毒组，分别对体外培养的HepG-2细胞进行处理，通过细胞涂片油红O染色观察细胞脂质沉积特征，应用生物化学及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测线粒体膜电位（ΔΨm）、线粒体肉碱棕榈酰转移酶 1(CPT-1)活性、游离脂肪酸（FFAs）和APN含量，免疫印迹检测磷酸化AKT（p-AKT）、线粒体谷胱甘肽S转移酶K1（GSTK1）和炎症因子半胱天冬酶1（Caspase-1）水平。 结果 相比对照组，SA染毒组显示细胞内脂质沉积，ΔΨm、CPT-1活性、GSTK1和APN水平下降，而FFAs、p-AKT和Caspase-1水平上调。相比SA染毒组，重组人APN干预后显示细胞脂质沉积程度减轻，ΔΨm、CPT-1活性、GSTK1和APN水平升高，而FFAs、p-AKT和Caspase-1水平下调。类似地，GSK690693干预后亦显示细胞脂质沉积程度减轻，ΔΨm、CPT-1活性、GSTK1水平升高，p-AKT和Caspase-1水平下调。 结论 砷诱导HepG-2细胞脂质沉积与AKT信号激活有关，脂联素可通过抑制AKT信号拮抗砷诱导肝细胞脂质代谢障碍及脂质沉积发生。

[关键词] 砷；HepG-2细胞；脂质沉积；脂联素；蛋白激酶B

砷作为一种环境高毒性化学污染物，可通过土壤、饮用水或食物污染，经消化道摄入而导致肝毒性，与非酒精性脂肪肝病、2型糖尿病、心血管疾病等慢性病发生风险增加密切相关[1-2]。实验发现，砷暴露可诱导小鼠肝脏胰岛素抵抗、肝细胞脂肪变性和肝脏脂质沉积[3]，但其分子调控机制尚不清楚。脂联素（adiponectin, APN）是由人体脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、肝细胞等多种细胞分泌的一种分子量约30 kDa、调节脂质代谢的小分子蛋白[4]，具有胰岛素增敏、抗氧化和抗炎效应[5]。线粒体是细胞内脂质代谢发生场所，既往研究发现APN与其受体adipoR1/2结合，可激活AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase, AMPK），AMPK进而刺激过氧化物酶体增殖物激活受γ辅激活因子 1α（PGC-1α）与过氧化物酶体增殖物激活受体 α（PPARα）的结合，诱导线粒体脂肪酸代谢酶如肉碱棕榈酰转移酶 1（carnitine palmitoyl transferase 1, CPT-1）表达，CPT-1 介导游离脂肪酸（FFAs）进入线粒体以完成克雷布斯（Krebs）循环，促进线粒体脂肪酸β氧化代谢[6-7]。因此，肝细胞线粒体功能障碍可导致脂肪酸 β 氧化障碍、FFAs 不能被氧化而通过酯化为甘油三酯（TG），从而以脂肪滴的形式积聚在肝细胞中，在肝细胞脂质沉积及肝脏脂肪变进程中扮演重要角色[8]。为探讨APN对砷诱导的肝细胞毒性的影响及其机制，本研究以体外培养的人来源肝细胞系HepG-2细胞为对象，应用亚砷酸钠（sodium arsenite, SA）染毒，探讨APN对其诱导HepG-2细胞毒性的干预效应及其分子机制。

结 果

1 脂联素和AKT抑制剂改善亚砷酸钠诱导的HepG-2细胞脂质沉积

为了分析脂联素或AKT抑制剂对SA诱导HepG-2细胞脂质沉积的干预效应，我们以rAPN（2.0 μg/ml）或AKT抑制剂GSK690693（1 μmo/L）作为预处理干预条件，对HepG-2细胞进行油红O染色，对其脂质沉积进行评价。结果显示，与对照组相比，SA染毒组HepG-2细胞脂质沉积程度显著增加，FFAs水平升高；与SA染毒组相比，rAPN或AKT抑制剂干预后显示HepG-2细胞脂质沉积程度减轻，细胞内FFAs水平明显降低，但仍高于对照组（图1）。由此说明，脂联素或AKT抑制剂干预可改善SA诱导HepG-2细胞脂质沉积。

图1 脂联素和GSK690693对亚砷酸钠（4 µmol/L, 48 h）诱导的HepG-2细胞脂质沉积的影响。A，脂质沉积的代表性油红O染色检测（比例尺，50 µm）；B，油红O染色检测的脂质沉积程度统计学分析；C，ELISA检测FFAs水平统计学分析；*P<0.05 vs Control组；#P<0.05 vs SA组。

讨 论

流行病学研究显示，环境砷暴露可导致人群非酒精性脂肪肝病、糖尿病发生风险升高[11]，而且，职业性砷暴露人群中亦发现肝脏脂肪沉积的影像学证据[12]。体外实验发现，线粒体脂质代谢障碍是细胞内脂质沉积发生的重要病理机制[13]，而APN作为一种小分子活性蛋白，可改善细胞线粒体糖脂代谢和线粒体功能[5]，具有抑制细胞生脂基因表达、抑制细胞内脂质合成[14]、以及抗氧化、抗炎效应[8]。本研究发现，砷染毒可诱导HepG-2细胞发生脂质沉积和线粒体脂质代谢功能障碍，呈现出线粒体膜电位、CPT-1活性、GSTK1和APN水平下降，FFAs和AKT水平上调的毒性特征，而rAPN或AKT抑制剂的干预对砷诱导的HepG-2细胞脂质沉积效应呈现出明显拮抗效应，由此提示，APN拮抗砷诱导肝细胞脂质沉积效应与AKT信号有关。

AKT是细胞内丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员，参与肝细胞内脂质合成调控。研究显示，线粒体功能障碍、线粒体DNA（mtDNA）释放可诱导磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信号通路激活[16]，AKT信号通路激活与细胞内脂滴和甘油三酯（TG）积聚密切相关[15]。而细胞内 AKT 信号抑制可上调线粒体二硫键氧化还原酶类似蛋白（DsbA-L）和APN表达水平[17]。DsbA-L又名谷胱甘肽S转移酶K1（GSTK1），在肝细胞线粒体表达丰富，是肝脏生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，GSTK1可促进细胞内APN的合成、分泌及高分子量多聚体形成[18]，具有改善线粒体氧化应激、增强肝脂肪酸氧化和减轻肝脏脂肪变性效应[5]。在本研究中，砷诱导HepG-2细胞线粒体功能障碍，进而发生AKT磷酸化激活以及GSTK1和APN水平下调。而rAPN或AKT抑制剂干预后线粒体膜电位上调，线粒体功能改善，导致AKT信号抑制和GSTK1水平上调，这可能是其改善HepG-2细胞脂质沉积的分子机制。此外，本研究还发现rAPN干预后HepG-2细胞炎症信号Caspase-1水平下调。Caspase-1是白细胞介素（IL）-17A/IL-1β—NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症信号通路激活的关键蛋白，Caspase-1水平下调可抑制IL-1β炎症因子分泌[19]。因此，APN干预抑制Caspase-1介导的NLRP3炎症信号通路，可能亦与其拮抗砷诱导的HepG-2细胞脂质沉积有关。

综上，本研究通过体外实验证实了砷暴露与肝细胞脂肪变性和肝脏脂质沉积的因果关系，而APN通过AKT信号拮抗砷暴露诱导HepG-2细胞脂质沉积，提示存在于人体外周血中的APN水平，对于维护肝细胞线粒体脂质代谢功能具有重要价值。APN对砷暴露HepG-2细胞中Caspase-1炎症信号的抑制效应，亦提示APN改善肝细胞炎症和维持肝细胞胰岛素敏感性的重要生理意义。未来可通过砷暴露和rAPN或AKT抑制剂干预的动物实验，以进一步证实APN通过AKT信号拮抗肝脏脂肪变的分子机制。

参考文献：略