CAR-T细胞治疗(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)是一种利用抗肿瘤免疫力进行癌症治疗的免疫治疗新方法。与传统免疫治疗相比，CAR-T具有改良的肿瘤抗原特异性和不依赖主要组织相容性复合分子的细胞毒性。近几年，关于CAR-T细胞的研究发展迅速，其中靶向CD19的CAR-T细胞治疗在晚期白血病和淋巴瘤患者中已显示出令人印象深刻的临床反应。随着近年来结直肠肿瘤发生率的升高，CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤方面取得的成功使得越来越多的临床研究致力于将其应用至结直肠癌在内的其他实体瘤的治疗中。然而，大量的临床研究结果并未达到预期。该文总结了CAR-T细胞的定义与结构、在实体瘤方面的现存挑战等方面，并在最后着重讨论了CAR-T细胞疗法在结直肠癌中的应用及未来前景。

1 CAR-T细胞的基本信息

1.1 CAR-T细胞疗法的定义及起源

CAR-T细胞的概念于1989年由GROSS等首次提出，它是指利用基因工程技术将识别目标抗原分子的抗体可变区基因片段和淋巴细胞免疫受体的胞内区片段相结合，通过病毒等载体转染到T淋巴细胞内，使其在T细胞表面表达融合蛋白，最终以非主要组织相容性复合物限制性的方式识别特定抗原杀伤肿瘤细胞。经过30多年的研究与发展，CAR-T细胞表现出强大的抗肿瘤活性。2011年以CD19分子为靶点成功治愈了晚期慢性B淋巴细胞白血病患者，自此开创了CAR-T治疗肿瘤的新纪元。

1.2 CAR-T细胞的基本结构

CAR-T免疫疗法中CAR的设计是关键。CAR的结构主要由3个部分组成，包括胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由抗原结合区域和铰链区组成，抗原结合域主要来源于抗体的单链可变片段（SCFV),SCFV在保留识别特异性的同时还能使T细胞以非MHC限制性的方式与靶抗原结合，这避免了肿瘤通过下调MHC进行免疫逃逸。铰链区是将SCFV与跨膜结构域结合的部分，这一结构也使SCFV具有一定的灵活性，以使它能够更好地绑定目标。跨膜区是连接细胞内外结构的桥梁，主要从T细胞分子的现有序列中分离得到。胞内区是激发免疫反应的关键，由共刺激信号域和活化区域组成。共刺激信号域的主要功能是增强T细胞的能力，如CD28和CD137。活化区域主要起到激活T细胞的作用，目前研究中多使用CD3ζ。根据不同的胞内结构域，现可将CAR-T分为四代。

纵观这四代CAR-T，第一代虽能靶向肿瘤细胞，但由于缺乏共刺激信号，临床研究证实其抗肿瘤作用较弱，第三、四代虽然增强了抗肿瘤作用但不良反应也随之增加，第二代CAR-T相对温和，目前在临床中应用更加广泛。

1.3 CAR-T在实体瘤方面应用的现状

CAR-T细胞疗法在实体瘤方面的应用困难重重。一项CAR-T治疗实体瘤效果的Meta分析[9]表明，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面整体有效率仅为9%。CAR-T细胞治疗实体瘤疗效不及血液系统恶性肿瘤的原因主要是由于二者存在诸多差异。第一，恶性血液病通常是播散性的，CAR-T细胞容易与在血液循环中的肿瘤细胞相遇并发挥作用，而实体瘤就相对局限；第二，实体瘤的组织微环境特点限制了CAR-T细胞的疗效；第三也是最大的挑战，血液系统恶性肿瘤的靶抗原往往是均匀的，而在实体瘤上表达的靶抗原大部分是异质的，在同一肿瘤的不同生长阶段也都大不相同。同时用来治疗实体瘤的靶点在正常组织上也有少量表达，因而在应用中存在脱靶的风险。

2 CAR-T在结直肠肿瘤方面的应用

结直肠癌是人类第三大最常见的恶性肿瘤，近几年早期筛查、手术、放化疗组合方案、免疫检查点抑制剂及靶向药物等综合治疗模式的应用大大改善了结直肠癌患者的生存期及生活质量，但其死亡率仍然很高，特别是在绝大多数的转移性结直肠癌患者中。相关统计指出Ⅳ期结直肠癌患者5年生存率仅12%，而约66%和61%的Ⅱ和Ⅲ期接受了辅助化疗和/或放疗等进一步治疗的患者，54%会在新辅助治疗后复发。因此，CAR-T细胞疗法有望弥补治疗这些患者的空白。

第一个相关的研究是在患有结肠癌伴有肝转移的患者中进行的，这项试验使用第一代CAR-T细胞靶向肿瘤相关糖蛋白-72，给药方式分为以递增剂量静脉注射及经肝动脉注射两种，这项研究证实了CAR-T治疗结直肠癌的安全性。在过去的几年里，免疫细胞疗法越来越多地应用于多中心临床试验，已有多项针对结直肠癌靶点相关的临床研究获得批准，表1总结了目前关于CAR-T细胞治疗结直肠癌的临床信息。

2.1 CAR-T细胞治疗结直肠癌的进展

2.1.1靶点的选择

CAR-T细胞治疗结直肠癌的靶点目前包括癌胚抗原（CEA）、间皮素（MSLN）、鸟苷酸环化酶C(GUCY2C）、上皮细胞黏附分子（Ep CAM）、人表皮生长因子受体2(HER2）、双蛋白样激酶1(DCLK1)。

CEA是诊断结直肠癌常用的指标之一，这是一种相对广谱的肿瘤标志物，难得的是，该标记物仅在胃肠道和肺组织的腔上皮中以非常低的水平表达，而在肿瘤细胞中该抗原广泛表达[21]，因此，它成为治疗结直肠癌的一个近乎理想的靶点。一项纳入10例CEA阳性转移性结直肠癌患者的Ⅰ期临床研究[4]表明，即使在高剂量下[108/（CAR·kg）]，靶向CEA的CAR-T细胞疗法在患者中也具有良好的耐受性。该研究表明了CAR-T细胞治疗CEA阳性的结直肠癌的有效性和安全性，同时表明CAR-T细胞的作用取决于扩增和持续的能力，CAR-T细胞的逐渐耗竭可能导致肿瘤复发。

Ep CAM又名CD326，是一种跨膜糖蛋白，在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用，是结直肠癌的主要表面肿瘤相关抗原之一，目前以此为靶点的单克隆抗体已被应用于结肠癌的治疗。ZHANG等[23]构建了识别Ep CAM的第三代CAR-T，在两种具有高表达水平Ep CAM的结肠肿瘤细胞系HT29和SW480的异体移植肿瘤模型中显著延迟了肿瘤的形成和生长，并在小鼠体内是安全的。

HER-2在结直肠癌中的表达目前存在争议，有报道[24]指出，HER-2在结直肠癌细胞膜上过表达率约为5%，在细胞质中过表达率达到了30%，这也许可以为靶向HER-2治疗结直肠癌奠定基础。对携带结直肠癌细胞小鼠模型的研究[24]表明，HER2特异性CAR-T细胞阻碍了免疫缺陷小鼠的肿瘤进展。另一项研究[25]发现，在小鼠模型中经HER2特异性CAR-T细胞处理过的小鼠的肿瘤进展受到抑制，表现出显著增加的总生存时间，并抑制了结直肠癌向肝和肺的远处转移。

MSLN是一种与细胞表面结合的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，目前已发现MSLN在结直肠癌中过度表达，其细胞外结构可分为膜远端区域（MDR）及膜近端区域（MPR），目前大多数基于MSLN的免疫疗法都针对MDR。但有研究证明相较于靶向MDR，靶向MPR的CAR-T细胞显示出更强的杀伤效果。研究表明，MSLN-CAR-T细胞疗法在原位结直肠癌肝转移小鼠及免疫重建人源肿瘤异种移植小鼠模型中取得了令人鼓舞的结果，实现了肿瘤微环境的由冷转热。

表1 CAR-T在结直肠癌方面的临床研究

注：NA，不详；FC，氟达拉滨和环磷酰胺；DL，剂量水平；HAI，肝动脉输注；d(s），剂量（s)

GUCY2C是主要存在于十二指肠到远端直肠的肠隐窝和绒毛细胞顶端的跨膜受体，在正常生理学中GUCY2C发挥调节液体和电解质稳态、维持肠道屏障完整性和抑制肠道肿瘤发生的作用。目前认为，GUCY2C配体的丢失是肿瘤发生早期非常普遍的步骤，这会导致基因组不稳定、代谢重编程和不受控制地增殖。临床前研究[30-31]表明，GUCY2C靶向的CAR-T细胞在转移性结直肠癌小鼠的试验中表现出强大的抗肿瘤活性。GCC19CART®是一种靶向GUCY2C治疗难治性转移性结直肠癌的CAR-T细胞疗法，在中国发起的早期临床试验中[32]，累计入组35例晚期结直肠癌患者分别接受2种剂量（1×106和2×106GCC19CART®cell/kg）治疗，2022年5月的数据[33]表明，GCC19CART®两种剂量水平表现出良好的总体客观缓解率，这一结果促使2022年4月19日FDA授予GCC19CART®快速通道资格，并在8月批准一项Ⅰ期多中心研究评估GCC19CART®对复发或难治性转移性结直肠癌受试者的安全性和耐受性研究，这表明靶向GUCY2C的CAR-T对治疗转移性结直肠癌具有巨大潜力。

对肿瘤细胞进行靶抗原标记，再设计针对靶抗原的CAR-T是近期出现的新策略。溶瘤病毒具有感染、复制和裂解肿瘤细胞的能力，在溶瘤病毒感染肿瘤细胞时会释放出肿瘤抗原激活T细胞，因此溶瘤病毒与CAR-T细胞具有协同作用[34]。PARK等利用溶瘤病毒OV-19t感染并标记肿瘤细胞，受病毒感染的肿瘤细胞表面会产生CD19，再用靶向CD19的CAR-T杀伤肿瘤细胞，试验发现应用OV-19t后可增加自身T细胞和CD19-CAR-T细胞的浸润，同时病毒对肿瘤细胞的感染具有逐渐扩大的播散效应，由此进一步放大CAR-T细胞的抗肿瘤作用。肠道的免疫功能与益生菌密切相关,VINCENT等开发了一种益生菌引导的CAR-T细胞（ProCARs）平台。ProCARs是将特定细菌定植于实体瘤内部，肿瘤定植的益生菌释放合成靶标，标记肿瘤组织以介导CAR-T细胞。该平台已在人类和小鼠癌症的多种异种移植和同基因模型中证明是安全有效的。

Arid5a是一种RNA结合蛋白，通过与IDO1 m RNA的3'非翻译区结合来稳定IDO1 m RNA,Arid5a的表达会随着结直肠癌的进展而增加。WU等[38]研究表明，Arid5a可促使IDO1的表达增强进而促进CD8+T细胞耗竭；Arid5a可通过增强色氨酸-犬尿氨酸代谢来促进癌症患者CD8+T细胞的耗竭，而犬尿氨酸的积累会激活芳香烃受体（Ah R），进一步加剧CAR-T细胞的耗竭。调节ARID5A-IDO1-Ah R轴可能可以克服实体瘤中的CAR-T细胞治疗耐药性并提高治疗效果。

2.1.2增强CAR-T细胞的浸润性

靶向肿瘤血管和间质以及增加趋化因子的表达是改善CAR-T细胞浸润到肿瘤组织中的重要方法。近几年也有研究者通过改变给药方式或联合化疗、使用肝素酶等手段打破实体瘤的屏障，增强CAR-T的抗肿瘤作用。

传统治疗联合CAR-T已经被广泛应用于临床研究。一项使用白蛋白紫杉醇联合环磷酰胺预处理的Ⅰ期临床研究表明，化疗通过对肿瘤基质的消耗和破坏，进而促进CAR-T细胞浸润并提升其抗肿瘤疗效。另一项临床前研究表明，局部放疗能够促进肿瘤血管通透性增加和抗原释放，从而增强CAR-T的浸润性及抗肿瘤作用。温和热疗具有破坏肿瘤基质及扩张血管的作用，CAR-T联合光热治疗也能够显著促进CAR-T的浸润，有研究[42]表明，具有光热-纳米催化双重性质的纳米酶能够增强小鼠模型中CAR-T细胞的浸润。

靶向肿瘤血管及基质对促进CAR-T细胞浸润更加直接。血管阻断剂康布他汀A-4磷酸酯（CA4P）是一种对肿瘤血管系统具有高选择性的血管干扰剂[43]。研究[44]表明CA4P联合HER2-CAR-T细胞治疗比单独使用CA4P或HER2-CAR-T细胞治疗具有更好的抗肿瘤效果，试验观察到CA4P可以破坏肿瘤血管，从而促进T细胞向肿瘤组织浸润，增强CAR-T细胞的增殖。

其他血管靶向药，例如贝伐珠单抗已被证实能够增强CAR-T细胞的浸润。为CAR-T细胞装配可以溶解肿瘤基质的酶是另一种可行的方法。在几种不同的体内异种移植模型中，CAR-T细胞配备肝素酶可改善浸润能力和抗肿瘤作用，同时未观察到毒性反应。利用透明质酸酶（PH20）遵循相同的原理，实验证实PH20可以增强胃癌和肝癌小鼠模型中CAR-T细胞的肿瘤浸润。癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤间质的重要组成部分，靶向成纤维激活蛋白（FAP）的CAR-T细胞被证实能够改善肿瘤模型中T细胞的浸润，提高CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。这种方法对于包括结直肠癌的其他实体瘤具有更加广泛的适应性，因此更加在临床中可能更容易应用。

局部或选择一定范围应用CAR-T细胞与静脉输注CAR-T细胞不同，这种方式对不同实体瘤的生物学行为及生长特征更有针对性，可以有效增加实体瘤内部CAR-T细胞的数量。一项Ⅰ期临床试验[51](NCT01373047）证实了通过经皮肝动脉输注的方式治疗CEA阳性肝转移结直肠癌的有效性及安全性。在之后进行的Ⅰb期临床试验[52](NCT02416466）使用CAT-T肝动脉灌注联合选择性内放射治疗CEA阳性肝转移结肠癌患者，结果表明在整个治疗过程中患者耐受良好，经治疗后血清CEA水平稳定或下降，中位生存时间达到了8个月。在设计CAR-T时引入核素荧光标记的手段使治疗过程中评估CAR-T细胞浸润效果更加直观精确。

2.1.3克服肿瘤微环境的限制

CAR-T细胞的持久性是实体瘤治疗中的一个挑战，因此提高CAR-T细胞的代谢适应性，减少CAR-T细胞的损耗是提高CAR-T细胞疗效的可行策略。

免疫刺激细胞因子在肿瘤微环境中含量很低，在CAR-T治疗过程中外源性补充IL-2等免疫刺激因子可提高免疫应答。目前一些使用IL-2提高疗效的研究多因IL-2相关毒性终止，因此对IL-2相关毒性加以控制是必需的。CHA等[54]构建了将IL-2与人源化抗CEA抗体结合的免疫性细胞因子（ICK），研究表明ICK能够增强CEA-CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并在小鼠模型中未观察到毒性。其他细胞因子如IL-12被证实可增加CEA-CAR-T细胞在体内的增殖、存活及细胞因子的释放[55]。能自主分泌IL-12和IL-18的第四代CAR-T已在实体瘤的临床前模型中均取得了良好的疗效。

免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞（MDSCs）在抑制性肿瘤微环境中发挥重要作用。目前临床中常用的削弱抑制性肿瘤微环境的方法是在免疫治疗前使用低剂量化疗，这种方法能够通过清除免疫抑制细胞来重塑肿瘤免疫微环境以增强CAR-T疗效。有研究提出，利用CAR-T细胞递送模式识别受体激动剂RN7SL1（一种激活RIG-I/MDA5信号的内源性RNA），能够显著抑制MDSCs发育进而促进CAR-T细胞的功能。

对肿瘤微环境中的免疫检查点的抑制信号进行阻断或者转化，可解除对CAR-T细胞的部分免疫束缚。典型的例子是将CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂联合应用，这种方法已在多种实体瘤临床前探索中被证实有效。LAG3是一种在活化的T和NK细胞上表达的抑制性免疫检查点，ZUO等通过对LAG3靶向阻断显著提高了CAR-T细胞在肝癌小鼠模型中的治疗效果。近年来也有研究者尝试将免疫检查点对CAR-T的抑制信号转变为刺激信号从而使免疫抑制得到逆转。有研究团队在以c-Met CAR的基础上添加了PD1/CD28嵌合开关受体（CSR),CSR是将PD-1的细胞外结构域与CD28的跨膜和细胞内结构域融合从而将PD-1的抑制信号转化为CD28的激活信号。结果表明，与CAR-T联合PD-1抗体相比，PD1/CD28 CSR的CAR-T具有更好的抗肿瘤效果。另有学者设计利用基因编辑技术去除CAR-T细胞中的PD-1受体，进而构建了对抑制信号低反应的CAR-T细胞。

2.2 CAR-T治疗结直肠癌面临的问题

2.2.1缺乏特异性靶点

CAR-T细胞是对T细胞强化后批量生产的“机器”，而靶点就是研究者为CAR-T制定的目标程序，这是CAR-T治疗肿瘤最重要的一步。理想的肿瘤靶点应在肿瘤组织中高表达，而在正常组织中不表达，同时不发生突变及免疫逃逸。目前大多数正在进行的临床试验所针对的抗原在正常组织中均有不同程度的表达，因此CAR-T相关的脱靶毒性是目前难以回避的问题,1例结肠癌患者接受高剂量CAR-T细胞治疗死亡的报道可能就与这样的脱靶毒性有关。肿瘤表面抗原会在肿瘤的发展过程中出现异质性和遗传不稳定性，且同一肿瘤在不同转移部位也会存在差异。因此，甄选在安全性及有效性上达到平衡的完美靶点是急需解决的首要问题。

2.2.2 CAR-T难以向实体瘤内部浸润

与正常组织相比，肿瘤血管呈现出无序排列性及结构的不完整性，纤维结缔组织的增生使得肿瘤基质更加牢固，在这种情况下，CAR-T细胞的浸润变得十分困难。大多数CAR-T治疗实体瘤的案例都是通过静脉输注的方式给药，这种方式意味着CAR-T细胞需要经过外周血循环至肿瘤部位才能发挥作用，这种空间和时间的滞后往往会限制CAR-T的增殖性和持久性。此外，肿瘤趋化因子的低表达及异常增生的肿瘤血管系统也会阻碍CAR-T细胞向实体瘤内部的浸润。

2.2.3肿瘤局部复杂的微环境

肿瘤微环境是一种免疫应答失调的环境，这种环境极不利于T细胞的生存和持续增殖[69]。大量免疫抑制因子存在于肿瘤微环境中，肿瘤微环境还富含肿瘤相关巨噬细胞、骨髓源性的抑制细胞和Treg细胞（调节性T细胞）等多种免疫抑制性细胞，这些细胞在抑制T细胞的同时，还能促进肿瘤的生长[70]。

3小结及展望

CAR-T细胞疗法从起源至今经历了不断地改进和发展，这种背负抗肿瘤任务的“机器”经过研究者的设计与验证逐渐变得复杂且强大。近年来CAR-T细胞在结直肠癌治疗领域已取得重要进展，MENG等利用质谱分析及免疫组化技术发现CD46在结直肠癌患者中过度表达，并与晚期和较差的总体生存率相关，研究人员以此构建CD46-CAR-T细胞，并通过与纳米治疗（携带细胞因子IL-2、IL-15和CCL5并使用叶酸修饰的镁硅酸盐空心纳米球）的结合，使CD46-CAR-T的抗肿瘤效力得到增强，这为CAT-T在实体瘤治疗方面提供了新的策略。针对Treg细胞，有研究者利用单细胞RNA测序分析了21例肠癌标本，发现CD177仅在肿瘤内Treg细胞中表达，提示CD177可作为CAR-T的潜在靶点。尽管这些策略尚未在结直肠癌的临床研究中得到验证，但随着相关研究的不断开展，CAR-T细胞将为结直肠癌患者带来更多希望。

文献来源

孙昭晨,蒋君妍,陈一天.CAR-T细胞在结直肠癌治疗方面的研究进展[J].实用医学杂志,2024,40(18):2640-2646.