导读

天然产物结构多样、具有多靶点调节的生物活性，是新药发现的重要来源。明确天然产物的作用靶点，可以将传统经验用药转化为机制驱动的精准医疗，为药物研发和转化医学提供关键突破口。

摘要

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤。寻找高效、低毒的天然药物并明确其直接作用靶点一直是研发难点。这篇Phytomedicine（中科院1区，IF≈8.0）2025年的研究完整呈现了一套经典的“以药找靶”研究范式，层层递进揭示了天然产物血根碱（Sanguinarine/Sang）通过抑制PKM2酶活抑制肿瘤进展的机制。

研究流程

作用机制

研究内容

01. 高通量筛选

研究团队先用FDA批准药物库（2698个）+自噬化合物库（984个）进行高通量表型筛选（IncuCyte实时活细胞分析系统），在CAL27和SCC9两种OSCC细胞中同时筛选出仅2个强效化合物——多柔比星（阳性对照）和Sang。Sang抑制效果与多柔比星相当，但副作用更小，成为天然抗OSCC的优选候选。

02. 以药找靶：LiP-MS“全扫描”捕获PKM2靶点+虚拟筛选辅助

Sang具有显著的抗癌活性，但在OSCC中的具体靶点和分子机制尚不明确。为了阐明对应的分子机制，本研究采用Limited Proteolysis-Mass Spectrometry（LiP-MS）化学蛋白质组学技术： Sang与蛋白结合后会“保护”特定酶切位点，导致肽段丰度发生特征性变化。 三浓度Sang处理CAL27细胞后，LiP-MS共鉴定出6个共同差异蛋白。

此外，结合虚拟筛选(Galaxy Sagittarius：结构+相似性双重预测），PKM2为唯一交集靶点。

03. 分子互作验证: SPR + MST定量亲和力

研究者进一步通过分子互作实验交叉验证了两者的直接结合：

· SPR（表面等离子共振）： 动力学分析显示Sang与PKM2具有极强的亲和力7.3 μM，达到微摩尔级别。

· MST（微量热泳动）：荧光标记PKM2与梯度Sang孵育，Kd = 2.6μM。

04. 结合位点解析：分子对接 + 分子动力学模拟 + 定点突变验证

分子对接预测得到了PKM2 与Sang 结合的3个潜在口袋。

此外，分子动力学模拟（100 ns，RMSD/RMSF/Rg/H-bond稳定性）锁定Site1最优。 MM-PBSA自由能计算显示F26残基贡献最大（ΔG最高），暗示其为结合的关键残基。

更进一步，构建PKM2 F26A突变体（KD&OE-WT vs KD&OE-F26A细胞系）：

· 对接得分大幅下降，结合彻底消失

· Sang对PKM2酶活的抑制作用被完全逆转

· 自噬指标（MAP1LC3B-II、SQSTM1、TAX1BP1）、溶酶体功能（LAMP1/2、LysoSensor pH）、细胞增殖全部恢复

这些数据共同揭示F26就是Sang结合并抑制PKM2的核心位点。

05. 最终机制模型：PKM2/TFEB轴

结合一系列的后续功能验证实验，研究团队确认了机制：Sang结合PKM2 (F26位点为关键残基) 后，抑制了其酶活性。PKM2与转录因子TFEB存在相互作用，Sang通过靶向PKM2，下调TFEB表达。从而减少溶酶体相关膜蛋白、改变溶酶体pH等途径损害了溶酶体功能，阻断了自噬流，最终抑制OSCC的进展。

Sang抑制口腔鳞状细胞癌进展的示意图模型：通过靶向 PKM2 抑制自噬流。

总结与启示

本研究展示了现代质谱技术在天然产物靶点鉴定中的强大威力。

· 技术亮点： 放弃了传统的生物素标记法（可能干扰活性），直接利用 LiP-MS 在天然状态下筛选靶点，该技术还可提供结合区域序列信息。

· 转化意义： 证实了Sang不仅是一个多效能分子，更是一个精准的PKM2抑制剂，为口腔癌的药物开发提供了坚实的理论依据。

参考文献:

[1] Peng YC, He ZJ, Yin LC, et al. Sanguinarine suppresses oral squamous cell carcinoma progression by targeting the PKM2/TFEB aix to inhibit autophagic flux. Phytomedicine. 2025;136:156337. doi:10.1016/j.phymed.2024.156337